摘要：目的比较复方丹参片及其拆方对血管性痴呆（VD）模型大鼠的学习记忆能力的改善作用和机制。方法通过穿梭箱筛选出学习记忆能力处于正常范围内的大鼠，随机分为假手术组、模型组、阳性药组（甲磺酸双氢麦角毒碱片0.65g/kg）、丹参组（丹参乙醇提取物0.3g/kg）、三七组（三七粉0.3g/kg）、复方丹参片组（0.3、0.6g/kg）组，ig给药，每日1次，预防给药7d后，通过双侧颈总动脉结扎再灌注法制备VD大鼠模型，连续给药7d后，进行穿梭箱实验和神经功能缺损评分；TTC染色检测脑梗死面积，Nissl染色检测大鼠大脑皮层病理变化；试剂盒法检测脑组织内超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）及血清血管内皮生长因子（VEGF）、内皮素（ET）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、白细胞介素-6（IL-6）等指标的变化。结果与模型组比较，复方丹参片组可一定程度地提高VD大鼠条件刺激回避次数，降低神经功能损害评分和脑梗死面积，减少大鼠脑组织MDA和血清ET、eNOS和IL-6水平，升高脑组织Ach、5-HT及SOD和血清VEGF水平；拆方研究显示，丹参提取物在减少大鼠脑组织MDA和血清ET、eNOS、IL-6水平，升高脑组织SOD水平方面较三七表现更出色；三七在提高脑组织Ach、5-HT含量方面表现更突出。复方丹参片高剂量组在提高SOD、降低MDA水平，提高Ach、5-HT、VEGF水平等方面优于单方组，与丹参组或三七组比较差异显著（P＜0.05、0.01）。结论复方丹参片能够较好地改善VD大鼠的认知学习记忆能力，其作用机制可能是通过增强中枢胆碱能神经系统分泌Ach的功能，提高海马及下丘脑区单胺类神经递质5-HT等的释放，减轻脑组织脂质过氧化损伤，抑制炎性损伤反应和促进血管生成等多条途径实现的。在复方中丹参提取物发挥主要作用，起到君药的作用，三七辅佐君药治疗VD。
近年来随着中国人口的老龄化进程加快，脑血管病发病率逐年上升，痴呆性疾病也随之而来，其发病逐渐呈现上升趋势。老年人常见的痴呆症种类包括：阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD）和血管性痴呆（vasculardementia，VD）。AD是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，以认知功能缺损为核心症状，以记忆障碍、执行功能障碍及人格和行为改变等表现为特征的获得性智能损害综合征。VD主要是由缺血性或出血性的脑损伤引起脑组织的血液循环障碍、脑功能减退，产生获得性认知功能损害或衰退的综合征，表现为记忆力、定向力、计算力等认知功能的减退以及情感行为的异常。然而无论是手术或是药物方面都没有完全治愈AD的有效方法，而VD是迄今为止唯一可以防治的痴呆，其早期治疗具有可逆性[1]。因此，研究有效治疗VD的药物就显得更加重要。
现代药理研究表明，中医药治疗VD具有一定疗效。复方丹参片为丹参、三七、冰片3味中药制成的复方制剂，具有活血化瘀、理气止痛的功效，临床上用于治疗冠心病、心绞痛。药理实验研究显示复方丹参片还具有调节机体脂质代谢、抗氧化[2]和减少并缓解脑外伤后缺氧所致的神经肽功能紊乱，清除血管瘀积，对抗血栓的形成及抗凝，减少脑损伤和脑水肿，促进脑组织的修复等重要作用[3-5]。其中，丹参可减少血小板聚集，具有抗菌、抗炎、抗凝、抗氧化、调血脂、脑神经保护和抑制成纤维细胞增生及分泌基质等药理作用[6-7]。三七的主要成分是三七总皂苷（PNS），其具有止血、抗血栓、抗炎、调血脂、保护脑组织[8]，增强抗脑缺血/再灌注损伤的作用[9]。冰片是经特殊工艺制作出的一种固态形式存在的分散物，可透过血脑屏障，并开放血脑屏障，促进其他药物透过血脑屏障[10-11]。
本研究通过观察复方丹参片、丹参乙醇提取物和三七分别对VD大鼠认知学习记忆能力、海马区组织改变、神经递质、氧化应激反应、炎性损伤和血管生成等相关指标的影响，探讨其改善VD大鼠学习记忆的可能作用机制及物质基础，为中医药防治VD提供实验参考依据。
1材料
1.1药品与试剂
复方丹参片（市售片剂，批号D17A，广州白云山和记黄埔中药有限公司）；丹参乙醇提取物（含丹参酮IIA.0～.3μg/g、丹酚酸B6.～8.mg/g，批号，广州白云山和记黄埔中药有限公司提供）；三七粉（批号，广州白云山和记黄埔中药有限公司提供）；甲磺酸双氢麦角毒碱片（批号6LT，天津华津制药有限公司）；注射用硝普钠（批号，华润双鹤药业股份有限公司）；注射用青霉素钾（批号，合肥中龙神力动物药业有限公司）；大鼠5-羟色胺（5-HT，批号-11）、大鼠丙二醛（MDA，批号-11）、大鼠超氧化物歧化酶（SOD，批号-11）、大鼠血管内皮生长因子（VEGF，批号-11）、大鼠内皮型一氧化氮合酶（eNOS，批号-11）、大鼠内皮素（ET，批号-11）、大鼠白细胞介素-6（IL-6，批号-11）、大鼠乙酰胆碱（Ach，批号-11）ELISA试剂盒均购于江苏酶免实业有限公司。
1.2仪器
JLBehv-STR-4大鼠穿梭箱、4通道大鼠穿梭实验视频分析系统（上海吉量软件科技有限公司）；TD电子天平（天津天马衡基仪器有限公司）；HHW21.AII电热恒温水箱（天津泰斯特仪器有限公司）；显微止血夹［上海医疗器械（集团）有限公司手术器械厂］；ASPS全自动脱水机、RM石蜡切片机、HI烤片台、GH加热石蜡包埋系统、DM显微镜（Leica公司）。
1.3动物
SPF级健康雄性SD大鼠，体质量（±10）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（京）-。动物饲养温度为（25±2）℃，湿度（50±10）%，自然昼夜节律光照，自购入时起适应性饲养7d后开始实验，期间自由摄食和饮水。
2方法
2.1动物分组、给药及造模
经大鼠穿梭箱筛选出学习记忆能力处于正常值范围（躲避电刺激平均时间＜25s）SD大鼠70只，随机分为7组（n＝10），即假手术组、模型组、阳性药组（甲磺酸双氢麦角毒碱片0.65g/kg）、丹参组（丹参乙醇提取物0.3g/kg）、三七组（三七粉0.3g/kg）、复方丹参片组（复方丹参片0.3、0.6g/kg），以上药物均用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液配制成所需浓度，ig给药；假手术组和模型组ig给予0.5%的羧甲基纤维素钠溶液。每组给药体积均为10mL/kg，1次/d，预防给药7d后造模。
除假手术组外，其余大鼠采用双侧颈总动脉结扎再灌注法进行造模。大鼠称体质量后ip10%水合氯醛溶液（3mL/kg）麻醉，仰卧位，颈前去毛，常规消毒，颈正中切口，分离两侧颈总动脉，ip硝普钠溶液（2.5mg/kg）。随即使用动脉夹夹闭两侧颈总动脉10min后，灌通10min，再次夹闭10min，灌通后缝合伤口，im青霉素钾（每只20万单位），放回笼中保温饲养。假手术组麻醉及手术过程同模型组，但不注射硝普钠及阻断双侧颈总动脉。术后第1天按上述方法开始ig给药，连续给药7d。
2.2神经功能损害程度和认知学习记忆能力测定
神经功能损害程度评分：给药结束后依据大鼠神经功能损害程度评分标准[12]进行评分。穿棱箱实验：实验时将大鼠放进打开挡板的穿梭箱适应5min，穿梭次数20次，间隙时间10s，光照及蜂鸣时间（10s），电击时间10s，电刺激电流0.8mA。记录大鼠受电击次数（被动逃避次数）、电击时间及主动逃避次数。大鼠完成一轮实验后，穿梭箱实验软件系统自动识别计算并导出结果。大鼠给药前起，每天训练1次，连续训练5d，给药结束采用同样刺激条件观察大鼠对刺激条件的回避次数。
2.3样本采集
2.3.1血标本采集第14天末次给药，进行神经功能损害程度和认知学习能力测试结束后，每只大鼠腹主动脉取血5mL，血液静置30min后，r/min离心10min，分离血清并分装，?20℃冰箱暂时冷冻保存。
2.3.2组织标本采集大鼠腹主动脉取血后，迅速在冰袋上断头取脑，置于?20℃冰箱下冷冻保存。
2.4TTC染色
取?20℃冰箱下保存的样本切片，约2mm/片，间隔取3个切片置于2%TTC中，于37℃的恒温水浴锅中放置15～30min，不时翻动脑片，使其均匀接触到染色液，观察脑梗死面积。将染后脑组织切片拍照输入计算机，ImageJ软件计算每个大脑3个脑片6个平面脑梗死面积和大脑总面积，以脑梗死面积占大脑总面积的百分比作为统计参数。其余脑切片用于Nissl染色和生化指标检测。
2.5Nissl染色
取样本用10%福尔马林固定液固定后，定位脑缺血区，常规脱水，石蜡包埋，冠状切片，片厚5μm，二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，Nissl染色液染色，中性树脂封片，光镜下观察大脑海马组织尼氏小体变化。
2.6生化指标检测
脑组织SOD、MDA、Ach、5-HT及血清VEGF、ET、eNOS、IL-6水平测定方法操作均按照试剂盒说明书进行。
2.7统计学分析
实验数据以表示，各组数据用SPSS17.0统计软件处理，各组间比较采用单因素方差分析。
3结果
3.1各组大鼠神经功能损害程度评分比较
对大鼠进行神经损害程度评分，模型组与假手术组比较评分显著升高（P＜0.01）；给药后大鼠神经功能损害得到不同程度地改善，与模型组比较，丹参组、三七组和复方丹参片低剂量组评分显著降低（P＜0.05），阳性药组和复方丹参片高剂量组评分降低非常显著（P＜0.01）；复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞复方丹参片低剂量组＞丹参组＞三七组。结果见表1。
3.2各组大鼠认知学习记忆能力比较
与假手术组比较，模型组大鼠回避反应次数显著减少（P＜0.01），说明大鼠经造模后其认知学习记忆能力明显下降。大鼠给药后的认知学习记忆能力得到不同程度地改善，与模型组比较，丹参组和复方丹参片低剂量组差异显著（P＜0.05），阳性药组和复方丹参片高剂量组差异非常显著（P＜0.01），三七组回避次数有所增加，但差异不显著（P＞0.05）；复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞复方丹参片低剂量组＞丹参组＞三七组，结果见表1。
3.3各组大鼠脑梗死面积比较
各组大鼠脑组织TTC染色后，正常组织染成红色，缺血部位染成白色。假手术组未发现有脑缺血现象，模型组与假手术组比较脑梗死面积显著增加（P＜0.01），表明脑缺血模型成功。给药后大鼠脑梗死面积均有不同程度减小，与模型组比较，丹参组、三七组明显减少（P＜0.05），阳性药组、复方丹参片低剂量组和高剂量组脑梗死面积减少更为显著（P＜0.01）；复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞复方丹参片低剂量组＞丹参组＞三七组，结果见表1。
3.4各组大鼠脑组织切片Nissl染色结果
Nissl染色后尼氏小体呈蓝紫色，当神经细胞合成蛋白质的功能较强时，尼氏小体大且数量多；神经细胞受到损伤时，尼氏小体的数量会减少甚至消失。假手术组的神经细胞排列规整，尼氏小体丰富，染色均匀。模型组的细胞损伤严重，排列紊乱，尼氏小体着色较浅。与模型组相比，给药组细胞状态明显好转，形态较完整，尼氏小体增多，染色较均匀，表明复方丹参片具有保护神经细胞的作用，其中阳性药组、复方丹参片高剂量组损伤减轻程度更为明显；复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞复方丹参片低剂量组＞丹参组＞三七组。结果见图1。
3.5大鼠脑组织各指标测定结果
3.5.1SOD活性、MDA水平比较与假手术组比较，模型组大鼠脑组织SOD活性明显降低，脂质过氧化物MDA水平明显升高，差异显著（P＜0.01）。与模型组比较，阳性药组、丹参组、三七组、复方丹参片低剂量组和高剂量组可显著提高SOD活性（P＜0.05、0.01）；阳性药组、丹参组、复方丹参片低剂量组和高剂量组可显著降低MDA水平（P＜0.05、0.01）。复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞复方丹参片低剂量组＞丹参组＞三七组。结果见表2。
3.5.2Ach、5-HT水平比较与假手术组比较，模型组大鼠脑组织Ach、5-HT水平明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，给药组均能升高脑组织Ach、5-HT水平，丹参组和三七组效果显著（P＜0.05），阳性药组、复方丹参片低剂量组和高剂量组效果非常显著（P＜0.01）。复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞复方丹参片低剂量组＞三七组＞丹参组。结果见表2。
3.6大鼠血清内各指标测定结果
与假手术组比较，模型组血清VEGF水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，复方丹参片低剂量组血清VEGF水平显著升高（P＜0.05），丹参组、复方丹参片高剂量组效果更为显著（P＜0.01），阳性药组和三七组未见显著升高（P＞0.05），复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞复方丹参片低剂量组＞丹参组＞三七组。结果见表3。
与假手术组比较，模型组血清ET水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，三七组ET水平显著降低（P＜0.05），丹参组、复方丹参片低剂量组及高剂量组ET水平降低更显著（P＜0.01），阳性药组差异不显著（P＞0.05）；复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞丹参组≈复方丹参片低剂量组＞三七组。结果见表3。
与假手术组比较，模型组血清eNOS水平明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，复方丹参片低剂量组eNOS水平显著升高（P＜0.05），阳性药组、丹参组、三七组、复方丹参片高剂量组eNOS水平升高更显著（P＜0.01）；复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞丹参组＞三七组＞复方丹参片低剂量组。结果见表3。
与假手术组比较，模型组血清炎症因子IL-6明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，三七组显著降低IL-6水平（P＜0.05），丹参组、复方丹参片低剂量组、高剂量组IL-6水平降低更明显（P＜0.01），阳性药组IL-6水平有所下降，但无统计学差异（P＞0.05）。复方及拆方作用强度比较，复方丹参片高剂量组＞复方丹参片低剂量组＞丹参组＞三七组。结果见表3。
4讨论
目前，VD的具体发病机制尚未完全阐明，缺血性卒中、出血性卒中和脑缺血缺氧等原因均可导致VD的发生。本研究采用缺血再灌注损伤方法，造成大鼠VD模型，使用复方丹参片及其拆方对模型进行干预，探讨其作用机制。
在脑缺血缺氧时，会产生过量自由基，从而影响生物体膜磷脂中的不饱和脂肪酸含量，导致过氧化及MDA产生，引起脑组织脂质过氧化损伤，进而引起认知功能障碍[13]。缺血损伤后产生的炎症因子又会对血管造成直接损伤，加重脑血管病变，使血管狭窄或闭塞进一步恶化，导致神经细胞凋亡，最终引起患者智能减退，出现不同程度的痴呆。IL-6属于细胞因子中的神经生成素家族，它可以促进星形胶质细胞聚集、激活小胶质细胞，刺激急性期蛋白的产生[14]。已有证据证实IL-6参与致炎过程[15]。一氧化氮（NO）是一种非典型神经递质，具有保护血管内皮细胞的作用，能够减轻氧化应激产生的损害，参与调节脑内血流、学习、记忆形成等生理过程。血管内皮细胞中NO的生成量主要取决于其合成关键酶eNOS的活性。ET是一种内源性长效血管收缩调节因子，缺血、缺氧状态下能刺激该物质的释放，导致脑组织缺血、缺氧进一步加重[16]。VEGF是具有特异性促进内皮细胞增殖的一类生长因子，缺血缺氧时可刺激大脑VEGF表达，促进内皮细胞增殖，诱导血管新生。大脑皮层中Ach及单胺类神经递质的减少与VD的认知障碍密切相关，当Ach合成不足时，学习记忆能力会受到影响[17]。5-HT是一种抑制性单胺类神经递质，主要分布于下丘脑和松果体，能增强记忆力，充足的5-HT可以在老化过程中防止脑损害发生。
本实验结果显示给予复方丹参片后VD大鼠的SOD升高，MDA下降，IL-6、ET降低，eNOS、VEGF升高，Ach、5-HT增加，表明复方丹参片防治VD的作用与抗氧化损伤、抗炎、血管调节、促血管生成、促进神经递质释放等机制有关。复方丹参片高剂量组在提高SOD、降低MDA，提高Ach、5-HT、VEGF等方面优于单方组，与丹参组或三七组比较有显著性差异。拆方研究显示，在抗氧化、调节血管收缩、促血管生成、抗炎等方面，丹参提取物的作用强于三七，发挥主要作用，起到君药的作用。三七在抗氧化、调节血管、抗炎方面作用弱于丹参提取物，在促进神经递质Ach、5-HT释放方面略强于丹参提取物，在血管因素和神经因素两方面，辅助君药治疗主证。
另有研究发现丹参酮IIA[18]、丹参素[19]、三七皂苷Rgl[20]、三七皂苷R1[21]等可以减少MDA含量，提高SOD活性，减轻氧化应激损伤，具有显著的抗氧化作用。丹参水提取物[22]、丹参酮IIA[23]、PNS[24]、三七三醇皂苷（PTS）[25]等均可使IL-6水平降低，抑制免疫炎症，具有抗炎作用。丹参酮IIA[26]、丹参素[27]等通过降低血浆ET-1水平及调节NOS的活性进而调节NO含量，促进NO合成；PNS[28]能够增加NO、eNOS生成，降低血浆ET-1水平；丹参多酚酸盐[29]、丹参素[30]能够上调VEGF的表达，减轻血管损伤，具有调节血管生成的作用。丹参的乙醇及水提取物[31]、丹参酮IIA[32]、三七皂苷Rg1[33]可以抑制AchE活性，减少AchE生成；三七皂苷Rg1可以下调AchE水平，升高Ach含量[34]，进而调节5-HT水平，具有调节神经递质的作用。上述成分可能是复方丹参片发挥作用的物质基础的组成部分，但其确切物质基础与作用机制的联系有待进一步研究。
参考文献（略）
来源：梁小娜，林娟，李新，徐旭，王德勤，王玉丽，匡艳辉，李晓霞，黄启和，侯文彬，郭海彪.复方丹参片及其拆方对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力的改善作用和机制探讨[J].中草药,,50(12):-.
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