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UPLC-Q/TOF-MS-BasedSerumMetabolomicsRevealsHypoglycemicEffectsofRehmanniaglutinosa,CoptischinensisandTheirCombinationonHigh-Fat-Diet-InducedDiabetesinKK-AyMice
基于UPLC-Q/TOF-MS的血清代谢组学揭示了地黄，黄连及其组合对KK-Ay小鼠高脂饮食诱导的糖尿病的降血糖作用
?期刊：InternationalJournalofMolecularScience
?IF:4.18
?发表时间：年12月
研究背景
糖尿病（DM）是一种复杂的代谢疾病，由多种因素相互作用引起，包括遗传易感性，行为和环境危险因素等，其特征主要是由胰岛素分泌不足和/或胰岛素抵抗引起的高血糖和血脂异常。由于血糖在患者体内升高会引起各种并发症，包括冠状心脏疾病，中风等，糖尿病已成为继心血管疾病和癌症之后的第三大常见慢性疾病。
黄连丸是由黄连（CC）和地黄(RG)的根组成，研究表明，其对糖尿病及其并发症有良好的治疗效果，且结合使用比其单味药有更好的药理学和治疗效果。黄连丸及其分离的草药成分的潜在抗糖尿病的分子机制，特别是在DM生物的代谢水平，研究较少。在该研究中，基于非靶向UPLC-Q/TOF-MS的代谢组学技术，研究单独的RG和CC及其组合对糖尿病KK-Ay小鼠血清中代谢物的潜在调节作用，并进一步比较它们的药理学差异。鉴定响应RG和CC和RG/CC对DM的治疗的代谢物，并预测其潜在的代谢途径。
研究样本
阳性对照组（MET）：饲喂MET（二甲双胍）的KK-Ay小鼠
RG实验组（RG）：饲喂地黄（RG）的KK-Ay小鼠
CC实验组（CC）：饲喂黄连（CC）的KK-Ay小鼠
RG/CC实验组（RG/CC）：饲喂地黄/黄连（RG/CC，1：1）的KK-Ay小鼠
模型对照组（M）：饲喂相同体积生理盐水的KK-Ay小鼠
正常对照组（C）：饲喂相同体积生理盐水的C57BL/6J小鼠
研究方法
生理指标测定：体重，血糖含量以及血糖耐量测定
生化分析：测定血清TC，TG，HDL-C和LDL-C的浓度
血清代谢组学分析：UPLC-Q/TOF-MS测定血清中代谢成分差异，后续进行PCA，OPLS-DA，糖尿病差异代谢物筛选
研究结果
1、RG，CC及其RG/CC组合降低HFD诱导的糖尿病小鼠的空腹血糖水平
在药物治疗56天期间，每7天测量所有实验组的体重和空腹血糖（FBG）水平，结果如图（1A，B）所示，研究发现，所有组的体重随着实验时间的增加而增加，并且药物组和模型对照组之间没有显着差异。连续喂食HFD后，模型对照组（M）小鼠的糖尿病加重，与模型组相比，所有四种药物均可有效抑制HFD诱导的FBG水平的进一步增加，其中二甲双胍（MET）比3种中草药（RG，CC和RG/CC）具有更好的控制和降低糖尿病小鼠FBG的能力。
图1.在实验的56天内，不同处理小鼠体重（A）和空腹血糖水平（B）的变化情况
2、RG，CC及其RG/CC组合改善糖尿病小鼠的葡萄糖耐量
在治疗的第8周，进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），以评价施用RG和CC和RG/CC是否改善了喂食HFD的糖尿病小鼠的抗高血糖活性。
在葡萄糖施用后，所有组的小鼠中的血糖水平在30分钟达到峰值，然后在两小时后几乎降低至其初始水平（图2A），与对照小鼠（C）和药物组（MET，RG，CC，RG/CC）相比，模型组（M）显示出较差的葡萄糖耐量，在每个相应的时间点，所有四个药物组和对照组的血糖水平显着低于未治疗的糖尿病KK-Ay小鼠，与RG/CC-和MET-施用组相比，施用RG-和CC-的小鼠的葡萄糖水平显示出更快的减少，并且在OGTT后1小时恢复到接近对照状态。与模型小鼠相比，RG-，CC-和RG/CC-施用组中的AUC显着降低（图2B），单一处方RG和CC在短时间内比他们的组合处方RG/CC和二甲双胍（MET）能更快地降低葡萄糖水平（图2C）。
图2.葡萄糖耐量测试结果；A葡萄糖饲喂之后不同时间小鼠体内血糖水平；BAUC：OGTT曲线下面积CiAUC：OGTT曲线下的增量区域
3、RG，CC及其组合（RG/CC）调节糖尿病小鼠的血清脂质水平
血脂异常通常发生在糖尿病生物体中。通过包括TG，TC，HDL-C和LDH-C的脂质指标评估RG，CC及其组合对糖尿病小鼠血清脂质代谢的影响。
结果如图3，HFD诱导的糖尿病小鼠血清TG，TC和LDL-C水平升高，通过给予二甲双胍（MET），RG，CC和RC/CC显着降低，与糖尿病模型小鼠相比，给予RG/CC显示血清TC，TG和LDL-C分别降低31.89％，36.87％和42.22％。
图3.不同处理对糖尿病小鼠给药8周后血脂的影响
4、RG，CC及其组合（RG/CC）对糖尿病小鼠血清代谢组学的影响
4.1数据质控
结果显示，14个QC样品处于正离子模式，6个处于负离子模式，均落在2SD区域和95％置信区间内，数据表明，该分析平台为大规模代谢组学研究提供了极好的精确度和可重复性。
图4.不同质量控制（QC）样品注射的PCA线得分图。X轴表示QC样品的运行顺序;Y轴分别表示标准偏差（A，B）和霍特林的T2范围（C，D）；（A，C）用于ESI+模式;（B，D），用于ESI-模式。
4.2血清代谢组学的全局多变量分析
根据小鼠血清样品的代谢分析，分别检测到个阳离子峰和个负离子峰，对模型组和对照组数据结果进行PCA和OPLS-DA分析，结果如图5，模型组和对照组之间的明显分离，表明它们之间的代谢特征差异显著。
图5.对照和模型组的血清代谢组学的PCA和OPLS-DA得分图。ESI+模式：（A，B）;ESI-模式：（C，D）;NC表示组件的数量。R2X和R2Y分别是所有R2X和R2Y的累积变化。Q2是累积预测分数
为了揭示在代谢物水平上施用RG，CC及其组合对糖尿病的降血糖作用，利用五组不同处理的血清代谢组学数据进行PCA和OPLS-DA分析。在正离子模式下（图6A，B），CC-和RG/CC-治疗的糖尿病组与对照组（C）和模型组（M）明确分开;RG和MET治疗的糖尿病组更接近模型组。表明RG，CC及其组合改变了糖尿病血清中的代谢物谱。CC-和RG/CC-治疗组比RG给药组更接近，表明与RG相比，CC和RG/CC对糖尿病的血清代谢组具有更多相似的药理作用。
图6.不同组的血清代谢物的PCA和OPLS-DA评分图。ESI+模式：（A，B）;ESI-模式：（C，D）
4.3RG，CC及其组合（RG/CC）对HFD诱导的糖尿病生物标志物的影响
图7显示了五组血清中代谢物变化的聚类热图，在阳离子模式中，与对照小鼠相比，在糖尿病模型组中发现总共79种代谢物表达不同。在糖尿病模型小鼠中，这些差异代谢物中的25种增加并且54种减少。在负离子模式中，总共76种代谢物显示来自对照小鼠的糖尿病模型组中的差异表达。与喂食正常饮食的对照小鼠相比，这些差异代谢物中有26种在糖尿病中被HFD升高，50种被降低。针对这些糖尿病调节代谢物的热图聚类显示MET-和RG-施用的小鼠具有与糖尿病模型组（M）相似的代谢物谱，而CC-和RG/CC-施用的组更接近正常对照组（C），表明CC和RG/CC显示出对糖尿病代谢物变化的更好调节能力。维恩图结果（图8）也表明CC在代谢物水平的糖尿病治疗中的主要功能。通过对糖尿病相关差异代谢物筛选发现，这些物质主要与脂质代谢相关。
图7.HFD诱导的差异代谢物在不同处理之间的分层聚类分析，（A）ESI+模式;（B）ESI-模式
图8.HFD诱导的糖尿病小鼠血清中差异代谢物的韦恩图
4.4RG和CC表现出与糖尿病小鼠代谢物相同的恢复趋势
为了找到三种草药治疗中药物敏感代谢物的趋势，我们对MCC和MRG，MRG/CC和MRG以及MRG/CC和MCC的OPLS-DA模型应用SUS-图分析（图9A-F）。尽管RG药物改变了糖尿病中较少的独特代谢物（图9A，D），但RG和CC在糖尿病中的代谢物水平具有相同的恢复趋势（图9A-F）。
图9.SUS图显示草药治疗之间共有和独特的代谢物。（A-C）：基于ESI+模式下的OPLS-DA模型。（D-F）：基于ESI-模式下OPLS-DA模型。MRG：模型与RG;MCC：模型与CC;MRG/CC：模型与RG/CC
研究结论
单独给予RG和CC及其组合可降低糖尿病小鼠的空腹血糖水平，改善葡萄糖耐受性，并恢复糖尿病小鼠血清中的总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）；CC和RG/CC具有更好的抗糖尿病作用；筛选到的15种糖尿病生物标记物主要是与脂质代谢相关。这些数据表明单独和联合治疗的RG和CC在降低血糖和改善脂质代谢方面具有抗糖尿病活性。
完
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